До сих пор проводимые исследования были клоногенетическими, среди прочих такие как: АТР-ТСА, МТТ и SRB. Эти исследования ограничены использованием образца ткани или в случае МТТ материалом опухолевого секрета. Эти исследования также основываются только на количественным анализом живых клеток с использованием косвенных параметров. Например:
● Исследование SRB использует сульфорадомин В, который связывает весь протеин клеток и при помощи колорометрического метода возможно находить число живых клеток в культуре раковой клетки ( это там, куда мы помещаем химикотерапевтическое лекарство в среду роста).
● В случае с МТТ, исследование основывается на тестирование тетразолина, который зависит от количества NADP NADPH.
● И наконец, исследование АТР-ТСА, которое измеряет производство АТР с использованием флюрометрического и фотометрического метода ( что, в свою очередь, измеряет катализ люцефирина энзимом люцефираза), требующего завершения митохондриального АТР.
К сожалению эти методы имеют большие недостатки и как следствие не имеют широкого клинического использования. Особенно:
● Исследование МТТ подвергается влиянию внутриклеточной концентрации и глюкозы и рН. Это измерение зависит от времени и временная точка должна быть очень чёткой.
● В случае с SRB , исследование легче и занимает меньше времени, чем МТТ, однако, оно основывается на том факте, что сульфародамин соединяет внутриклеточный протеин с последней амино-точкой и это является косвенным фактором жизнеспособности клеток. Также, исследование SRB, как все другие химико-чувствительные исследования, не может быстро и оперативно предоставить информации о развитии механизмов сопротивления ни информацию о метастатической способности опухоли через нео-ангиогенезис.
● Эти исследования (АТР-ТСА, МТТ, SRB, Disc и другие) не могут предсказывать чувствительность сопротивления за короткие временные рамки (клоногенетическое исследование требует примерно 20 дней на завершение). Выше упомянутые исследования дают только минимальный объём информации по злокачественному фенотипу рака и не предлагают решений по избежанию или направлению в обратную сторону механизмов сопротивления. Дополнительно, эти анализы не могут предсказать уровни токсичности, возникающие при использовании химико-терапевтических лекарств, таких как: 5-FU и не даёт какой-либо информации о таких лекарствах ( т.е. категорию биологических модификаторов).
EXPRESS Medical Center PC предоставляет услуги, которые перекрывают выше перечисленные недостатки при помощи использования микро-схемного чимико-чувствительного теста (CST) , что даёт гарантию использования не только образца ткани из опухоли или материала опухолевого секрета, но и также переферической (всей) крови у больных на IV стадии рака. Используя образец всей крови мы выполняем:
● Изолирование циркулирующих раковых клеток с использованием градиентного раствора и мембран с порами.
● Продолжение негативный отбор с использованием цитоспина и анти CD+45 ( эти антитела связываются гематологическими клетками и отделяют их от эпителиальных злокачественных клетка).
● продолжения положительного отбора с использованием антитела EpCam , которое соединяет и изолирует через цитоспин эпительную первоначальную клетку (раковую клетку).
● Идентификацию изолированных злокачественных клеток с использованием набора определения иммортализации из Oncogen.
● Развитие многих клеточных культур в 96 ячейках и в каждую ячейку добавлять культурную среду отличную от химико-терапевтического лекарства.
● Затем каждые 24 часа произведение экстракта каждого маленького образца культуры и изолирование mРНК.
● Произведение сДНК при наличии RT-PCR.
● Следование микро-схемной гибридизации и колориметрическому микро-схемному анализу (рис 1) с использованием образцов, ниже перечисленных ген:
TS, DHFR, табулин a and b, фактор транскрипции табулина а. топоизомираза I and II (a&b), SHMT, DPD, TP, p27, p53, ДНК метилтрансфераза, О6 ацетилтрансфераза, MRP (I&II), LRP, GST, VEGF, PDGF, EGF, TGFb, IGF, MMP9, нуклеотид редактаза, COX-2, 5-LOX, SS-r, c-erb-B2.
Чтобы быть более точным, тимидилат синтаза и DHFR известные гены, производящин энзимы очень критичные для фолиевой дорожки. Данная дорожка является единственным биохимическим способом для клеток производить тимидин нуклеотид , который в свою очередь необходим для удвоения ДНК и клеточного деления. Когда раковые клетки сопротивляются анти-фолиатам таким как: метотрексат и 5флюрорасил, они они перемоделируют эти гены до точки, когда количество энзимов становится таким большим, что ингибитор ahs находится в очень большой концентрации и это не позволяет ингибитору связываться с ними. В добавок мы должны упомянуть, что особенно в случае с 5-FU мы тестируем стимуляцию DPD and TP, что катализирует трансформацию 5-FU в 5 FUMP – активный продукт. Если дейтельность этих генов нерегулярна, 5FU не может хорошо трансформироваться и токсины также становятся очень сильными.
Когда это подходит к перекрёстному связыванию ДНК и реорганизации энзимов, топоизомераза I and II и все их изоформы производят энзимы , которые становятся целями для антраксициклина, камтотецина, эпиподофилина и соединений адриамицина. Эти энзимы критичны на фазе S во время клеточного цикла ( при удвоении ДНК) и восстановительных механизмах ДНК. К сожалению, механизмы сопротивления для выше перечисленных ингибиторов зависят только от сверх-симуляции р гликопротеиновых насосов MDR1, MRP and LRP в ткани лёгкого.
Гены, производящие табулин a and b и все их изоформы являются критичными для формирования ядерной оси. Алкалоиды Винка , связанные с табулином В, препятствуют формированию оси и месту клеточного цикла на стадии метафазы. Таксаны , связанные с регуляторами табулина a и b должны делать ядерную ось такой устойчивой, что де-полимеризация становится невозможной. С этим механизмом таксаны останавливают клеточный цикл на телофазовой стадии. К сожалению и алкалоиды Винка и таксаны становятся целями мембрановых насосов MDR1, MRP1 и LRP или мутаций, особенно в генах табулина b, делая молекулу неспособной связываться с ингибиторами.
Дополнительно ДНК метилтрансфераза, О6 ацилтрансфераза и демитилаза ДНК являются генами, вовлеченными в метилацию ДНК, которая регулирует наматывание и разматывание генов. Особенно в раковых клетках, гиперметилация ДНК является одним из механизмов сопротивления и регуляции ракового фенотипа и его поведения. Также эти гены вовлечены в механизм подавления алкилирующих лекарств.
В конце концов гены VEGF, FGF и PDGF вовлечены в процедуру ангиогенеза. Ангиогенез необходим для метастатических процессов. Гены TGF, EGF и IGF и соматостатин (соматомедин) сверх стимулируются в раковых клетках, что провоцирует снова и снова определенные рецепторы мембраны, которые также сверх-стимулируются, что в свою очередь создаёт механизм позитивной обратной связи роста клетки и митоза без окончания начала иммортализации. Экосаноиды также вовлечены как факторы роста или факторы транскрипции в карциногенез и в раковые фенотипы клетки. Частично. Сверх-стимуляция чиклоксигеназа 2 и 5 липоксогеназа критична для выше указанного процесса. Исследования уже показали, что угнетение этих энзимов (коксибов или аналогов триена) вевдёт ремиссии роста раковой клетки.
Фармацевтические субстанции используемые и вводимые в культурную среду:
● оксалиплатин ● митомицин ● иринотекан ● тауролидин
● цисплатин ● прокарбазин ● топотекан ● 5флюрорасил
● циклофосфамид ● дакарбазин ● идарубицин ● урацилтегафур
● ифосфамид ● блеомицин ● этопозид ● ралтитрекст
● трофосфамид ● темозоламид ● митоксандрон ● флоксуридин
● треосульфан ● естрамустин ● паклитаксел ● капецитабин
● мельфалан ● доксорубицин ● доцетаксел ● пеметрекст
● СCNU ● епирубицин ● винкристин
● BCNU ● даунорубицин ● винбластин
● ACNU ● дактиномецин ● винорелбин
Мы также проверяем био-наличие клеток с использованием окрашевающей субстанции (Голубой Трипан 0.4%) и делаем микро-фото.Голубой Трипан является наиболее надёжным методом измерения жизнеспособности клеточной культуры. Голубой Трипан является уникальным аналогом аминоптерина, который может в фолиевом цикле ( жимическая дорожка, которая критична и сверхактивна в раковых клетках). Благодаря этому факту, этот аминоптерин не может проходить свозь мембрану клетки, он окрашивает её в голубой свет без окрашивания внутреннюю область клетки. В клетках Дебрис (мертвых клетках) Трипан может проходить сквозь поврежденную мембрану и он может окрасить всё тело клетки в ярко синий свет. Из 6 образцов, которые мы берём каждые 6 дней , мы способны строить график жизнеспособности на каждое химикотерапевтическое лекарство. Эта процедура выполняется один раз каждые 24 часа в течении 6 дней. Данные микро-схемы так же как и микрофотографии каждого случая отсылаются в наши лаборатории для анализа и оценки на компьютерах.
Также
мы тестируем 50 самых популярных субстанций, убивающих рак. Мы делаем
экстракт
активных компонентов и затем тестируем их на раке больных пациентов.*
Имея на руках вышеперечисленные данные, мы составляем безопасный профиль и генетический и цитологический для неоплазматических клеток на каждый случай. В результате, мы способны сделать вывод , к каким особым фармацевтическим субстанциям чувствительны клетки и к каким есть сопротивление, быстро и безопасно.
Также
мы тестируем 50 самых популярных субстанций, убивающих рак. Мы делаем
экстракт
активных компонентов и затем тестируем их на раке больных пациентов.*
* Для более подробной информации смотри анализ образца.